În primul rând, atât EcoR1, cât și Xba1 lasă supraîncărcări de 5’ atunci când digeră ADN-ul (la fel ca și Nde1). În ambele cazuri capătul 3’ este îngropat, motiv pentru care polyermase poate adăuga baze. În al doilea rând, toate polimerazele pot adăuga baze doar la un capăt de 3', astfel încât Klenow va adăuga 4 baze la capătul retras de 3' al ambelor site-uri pentru a genera capete contondente.
Lasă enzimele de restricție un 5 fosfat?
Vectorii și inserțiile digerate de enzimele de restricție conțin modificările terminale necesare (5' fosfat și 3' hidroxil), în timp ce fragmentele create prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) nu pot.
Capetele contondente pot fi legate?
Ligare la capătul tocit
Legarea la capătul tocit nu implică împerecherea bazelor capetelor proeminente, astfel încât orice capăt tocit poate fi legat de un alt capăt tocit. Capetele tocite pot fi generate de enzimele de restricție precum SmaI și EcoRV.
Taq polimeraza produce capete tocite?
Da… Taq Polymerase adaugă A-Overhangs dacă mențineți pasul final de extensie la 72 dC pe PCR. Folosit în principal pentru clonarea TA.
De ce să folosiți fragmentul Klenow în secvențierea ADN-ului?
Fragmentul Klenow este extrem de util pentru sarcini bazate pe cercetare, cum ar fi: Sinteza ADN-ului dublu catenar din șabloane monocatenar . Umplerea capetelor retrase de 3’ ale fragmentelor de ADN pentru a face ca proeminența de 5’ să fie tocită . Digerarea proeminente de 3'.
